尺寸排阻層析（SEC），又稱凝膠過濾層析或者分子篩，當某液體流經多孔的凝膠結構時，按照溶液中各分子的物理尺寸不同，將液體流動相中各分子進行分離。直徑大于填料孔徑的分子無法進入孔里面，它們被完全排除，迅速通過柱子，并首先洗脫。按分子量大小的順序，直徑越小的分子，越能夠進入填料的孔隙間，能滲入的體積也越大，洗脫也越晚。因為尺寸排阻層析（SEC）法對分子沒有吸附能力，其分離機制會使樣品稀釋洗脫，故通常它不用于層析工藝中的捕獲階段或中間純化步驟。有時它可用作最后的拋光精制階段，即將目標蛋白從其聚合物或其他分子量顯著不用的雜質中分離出來。另一個應用領域是將純化后的目標蛋白脫鹽。